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Questo era particolarmente importante da guardare negli organoidi delle vie aeree come molto poco si sa sulla criptosporidiosi respiratoria, e la cellula ospite esatta per il parassita non era conosciuta. Abbiamo condotto analisi dell'immunofluorescenza sugli organoidi infettati da Cryptosporidium, co-localizzando CC10, un marcatore per le cellule del club e abbiamo scoperto che il Cryptosporidium ha infettato sia le life cycle of cryptosporidium parvum negative che quelle positive CC10 Figura 3.

Questi risultati sono stati confermati dai TEM in cui abbiamo osservato il Cryptosporidium infettare le cellule secretory e non secretorie nelle organoidi Dopo che gli organoidi differenziati sono stati infettati per cinque giorni, ci dovrebbe essere un numero significativo di life cycle of cryptosporidium parvum prodotti.

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Nelle nostre mani, l'infezione degli organoidi da una piastra a sei potraha prodotto circa oocisti, che potevano essere facilmente identificati e contati su un emocitometro etichettando con un anticorpo specifico per le ovocisti.

La presenza di quattro sporozoiti nelle oocisti potrebbe essere confermata asciugando una parte life cycle of cryptosporidium parvum oocisti su un vetrino adesivo, fissando con metanolo e combinando la colorazione DAPI con anticorpo specifico di life cycle of cryptosporidium parvum Figura 4.

La verifica della produzione di oocisti murari spessi potrebbe essere effettuata mediante l'analisi TEM Figura 1: Preparazione e purificazione di oocisti e sporozoiti di Cryptosporidium. A Rappresentazione schematica del metodo utilizzato per la preparazione dell'oocisti e della sporozoite per l'infezione.

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B Immagine che mostra in vitro excystation di oocisti. La filtrazione di ovociti e conchiglie non esorditi dà una soluzione purificata di sporozoiti. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più life cycle of cryptosporidium parvum di questa figura.

Figura 2: Microiniezione di oocisti nel lume organoide.

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Questa cifra è stata modificata da Heo et al. A immagini di microscopia elettronica a scansione SEM di oocisti e sporozoiti. B Immagine che mostra organoidi iniettati di oocisti. Il colorante verde aiuta a visualizzare l'iniezione di ogni organoide e persiste su almeno 24 h.

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C Immagine di un organoide iniettato con oocisti. Figura 3: Immagine immunofluorescenza di Cryptosporidium -infettato organoide delle vie aeree.

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La mucina è etichettata con anticorpo anti-mucina 5 rosso nel lume dell'organoid, le cellule del club sono etichettate con anti-CC10 gialloCryptosporidium viene rilevato con anticorpo oocyst-specifico verdee i nuclei cellulari sono macchiati con DAPI blu. Pannello B è un allargamento dell'area indicata life cycle of cryptosporidium parvum quadrato nel pannello A.

Figura 4: Immagine immunofluoreescenza di oocisti isolati da organoidi intestinali differenziati.

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La parete oocyst è etichettata con anticorpo specifico di oocisti in verde e i quattro nuclei sporozoite sono visualizzati con DAPI blu Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. La coltura dei parassiti life cycle of cryptosporidium parvum Cryptosporidium negli organoidi intestinali e delle vie aeree fornisce un modello accurato per studiare le interazioni ospite-parassita 10, ma ha anche molte altre applicazioni.

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Ad esempio, gli life cycle of cryptosporidium parvum metodi di selezione e propagazione dei parassiti del Cryptosporidium geneticamente modificati richiedono un passaggio nei topi 19, il che non consente l'isolamento dei parassiti che hanno modifiche essenziali source l'infezione in vivo. La cultura organoide del Cryptosporidium offre un'alternativa a questa procedura. Tuttavia, abbiamo notato che le sporozoite elettroporate si aggregano e bloccano la micropipetta.

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Allo scopo di selezionare parassiti geneticamente modificati, gli organoidi possono essere coltivati su trasguarsi rivestiti link collagene in un formato bidimensionale in condizioni di differenziazione per consentire l'infezione da sporozoiti trasaffetti e di conseguenza la selezione di le oocisti geneticamente modificati.

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Il successo degli esperimenti qui descritti dipende fortemente dalla vitalità e dall'infettività delle oocisti. Diversi lotti di oocisti Cryptosporidium possono variare ampiamente nei tassi di escissioni e capacità di infettare le cellule ospiti.

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Le rese sufficienti di sporozoiti dipendono da buoni tassi di escisazione e il tasso di escissione non è sempre correlato all'infettività. Se si osservano bassi livelli di infezione o scarsa esostation con un particolare lotto di oocisti, il tempo e lo sforzo possono essere risparmiati ottenendo un nuovo sacco di oocisti piuttosto che tentare di aumentare il numero life cycle of cryptosporidium parvum oocisti, o allungando i tempi di incubazione.

I supporti di coltura https://ostrov.ru.com/pinot/14-01-2020.php devono essere aggiornati ogni giorno alternativo. Si consiglia l'uso di passaggi precedenti di colture organoidi.

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È importante scongelare una nuova fiala di organoidi se gli organoidi iniziano a differenziarsi nei passaggi successivi poiché la life cycle of cryptosporidium parvum delle colture organoidi determina ampiamente la vitalità del parassita. Dopo l'infezione, i supporti organoidi dovrebbero essere aggiornati ogni giorno per evitare l'accumulo di sostanze tossiche nei supporti.

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Tuttavia, fino ad oggi, nessun altro metodo consente l'intero ciclo di vita in un sistema in vitro completamente rappresentativo dell'infezione umana, né è stato descritto alcun sistema di coltura che consenta di l'esplorazione delle interazioni ospite-patogeno importanti per infezione respiratoria. La life cycle of cryptosporidium parvum organoide del Cryptosporidium fornisce un nuovo potente strumento che apre vie di esplorazione in interazioni ospite-parassita non precedentemente possibili per Cryptosporidium.

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Cryptosporidium parvum è una delle principali cause della malattia della diarrea umana. Per comprendere la patologia del parassita e sviluppare farmaci efficienti, è necessario un sistema di coltura in vitro che riassume le condizioni nell'ospite.

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Gli organiidi, che assomigliano molto ai tessuti della loro origine, sono ideali per studiare le interazioni ospite-parassita. Gli organiidi sono strutture derivate da tessuti tridimensionali 3D che derivano da cellule staminali adulte e crescono in coltura per life cycle of cryptosporidium parvum periodi di tempo senza subire alcuna aberrazione genetica o trasformazione.

Hanno una polarità ben definita con superfici apicali e basolaterali.

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Gli organiidi life cycle of cryptosporidium parvum varie applicazioni nei test farmacologici, nel bio banking e nella modellazione della malattia e negli studi sull'interazione tra host e microbo.

Qui presentiamo un protocollo passo-passo di come preparare le oocisti e sporozoiti di Cryptosporidium per infettare gli organoidi intestinali e delle vie aeree umane.

Ci sono tre metodi life cycle of cryptosporidium parvum con cui gli organoidi possono essere utilizzati per gli studi di interazione host-microbe: microiniezione, tosatura meccanica e placcatura, e facendo monostrati.

La microiniezione consente il mantenimento della struttura 3D e consente un controllo preciso dei volumi di parassiti e il contatto laterale apicale diretto per i microbi.

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Forniamo dettagli per una crescita ottimale degli organoidi per la life cycle of cryptosporidium parvum di imaging o oocisti. Infine, dimostriamo anche come le oocisti appena generate possono essere isolate dall'organoid per un'ulteriore elaborazione e analisi a valle. Lo sviluppo di farmaci o vaccini per il trattamento e la prevenzione dell'infezione da Cryptosporidium è link ostacolato dalla mancanza di sistemi in vitro che imitano precisamente la situazione in vivo nell'uomo 12.

Molti dei sistemi attualmente disponibili consentono solo l'infezione a breve termine 34.

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Altri sistemi che consentono il completo sviluppo del parassita si basano su linee cellulari immortalate o linee cellulari tumorali che non ricapitolano fedelmente la situazione life cycle of cryptosporidium parvum nell'uomo 567.

Gli organoidi o "mini-organi" sono strutture derivate di tessuto 3D che vengono coltivate in una matrice extracellulare integrata con vari fattori di crescita specifici del tessuto. Gli organiidi sono stati sviluppati da vari organi e tessuti. Sono geneticamente stabili e riassumono la maggior parte delle funzioni degli organi della loro origine, e possono essere mantenuti in coltura per lunghi periodi di tempo.

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life cycle of cryptosporidium parvum Abbiamo sviluppato un metodo per infettare gli organoidi intestinali e polmonari umani con il Cryptosporidium che fornisce un modello accurato in vitro per lo studio delle interazioni ospite-parassita rilevanti per la criptosporidiosi intestinale e respiratoria 89101112 A differenza di altri modelli di coltura pubblicati, il sistema organoide è rappresentativo delle interazioni reali dell'ospite, consente il completamento del ciclo di vita in modo che tutte life cycle of cryptosporidium parvum fasi del ciclo di vita dei parassiti possano essere studiate e mantenga la propagazione dei parassiti per this web page massimo di 28 giorni e Cryptosporidium parvum è un parassita apicomplexa che infetta l'epitelio dei tratti respiratori e intestinali, causando una malattia di diarrea prolungata.

Lo stadio ambientale resistente è l'oocisti, che si trova negli alimenti e nell'acqua contaminati Una volta ingerito o inalato, l'oocisti si estingo e rilascia quattro sporozoiti che si attaccano alle cellule epiteliali.

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Gli sporozoiti scivolano sulle cellule ospiti e coinvolgono i recettori delle cellule ospiti, ma il parassita non invadere completamente la cellula e sembra indurre la cellula ospite a inghiottirla Il parassita, che viene interiorizzato all'interno di un compartimento intracellulare life cycle of cryptosporidium parvum extracitoplasmatica, rimane sulla superficie apicale della cellula, replicandosi all'interno di un vacuolo parassofoso. Subisce due cicli di riproduzione asessuata, un processo chiamato merogonia.

Durante la meroginia, si sviluppano meronts di tipo I che contengono otto merozoiti che vengono rilasciati per invadere nuove cellule.

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Questi merozoiti invadono nuove cellule per svilupparsi in meront di tipo II contenenti quattro merozoiti. Questi merozoiti, una volta rilasciati, infettano le cellule e si sviluppano in macrogamont e microgamont.

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I microgameti vengono rilasciati e fertilizzano i macrogameti che producono zigoti che maturano in oocisti. Le oocisti mature vengono successivamente rilasciate nel lume.

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Le oocisti sono o a parete sottile che immediatamente si estesciper reinfettare per reinfettare l'epitelio, o spesse mura che vengono rilasciate nell'ambiente per infettare il prossimo ospite Tutte le fasi del ciclo di vita di Cryptosporidium sono state identificate nel sistema di coltura organoide precedentemente sviluppato dal nostro gruppo Dal momento che gli organoidi umani replicano fedelmente life cycle of cryptosporidium parvum tessuti umani 91113e supportano tutte le fasi replicative del Cryptosporidium 10sono il sistema di coltura dei tessuti ideale per studiare Biologia del cryptosporidium e interazioni ospite-parassita.

Qui descriviamo le procedure per infettare gli organoidi sia con le oocisti di Cryptosporidium che con gli sporozoiti eccitati e per isolare le nuove oocisti prodotte in questo sistema di coltura tissutale. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Tutta la manipolazione e la resezione dei tessuti è stata eseguita in base ai protocolli approvati dall'IRB Institutional Review Board con il consenso del paziente.

NOT: Cryptosporidium oocisti sono stati acquistati da una fonte commerciale vedi life cycle of cryptosporidium parvum Tabella dei Materiali.

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Queste oocisti sono prodotte in vitelli e sono conservate in salina tampone di fosfato PBS con antibiotici. Possono essere conservati per circa 3 mesi a 4 gradi centigradi e non devono mai essere congelati.

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Normalmente usiamo le oocisti entro un mese. Gli organoidi possono essere infettati da oocisti intatti, o gli sporozoiti possono essere isolati dalle oocisti eccitati e utilizzati per infettare gli organoidi se è importante non avere life cycle of cryptosporidium parvum riporto dall'inoculo originale.

Cultura in vitro degli organiidi intestinali e polmonari per microiniezione. I protocolli qui presentati si traducono in un'efficiente purificazione di oocisti e sporozoiti Figura 1A pronti per la microiniezione.

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Inoltre, l'aggiunta di un coloranti verde aiuta life cycle of cryptosporidium parvum garantire l'iniezione di tutti gli organoidi e consente la visualizzazione di organoidi iniettati per almeno 24 h dopo l'iniezione Figura 2B. Questi protocolli per la preparazione di oocisti e sporozoiti sono semplici e sono stati utilizzati per molti anni, quindi si prevede che le oocisti trattati e gli sporozoiti purificati saranno vitali e infettivi.

La criptosporidiosi è l'infezione da Cryptosporidium.

Tuttavia, nei nostri studi, abbiamo usato la microscopia elettronica a scansione per garantire che il processo di escissimento non danneggi le sporozoiti o le oocisti Figura 2A Una parte degli organoidi infetti dovrebbe essere impostata per verificare la propagazione dei parassiti mediante PCR quantitativa come abbiamo descritto I progressi nel ciclo di vita dei parassiti possono essere visualizzati mediante la raccolta di organiidi infetti in diversi punti temporali dopo l'infezione e l'analisi mediante microscopia elettronica di trasmissione o life cycle of cryptosporidium parvum immunofluorescenza combinata con 4,6-diamidinofenilitinele DAPI colorazione dei nuclei parassiorati click the following article Ad esempio, gli anticorpi agli antigeni della superficie di merozoite, come gp40 e gp15 17 life cycle of cryptosporidium parvum essere utilizzati per identificare gli stadi di meront; meronts di tipo I avranno 8 nuclei e meront di tipo II, 4 nuclei Recentemente, un pannello di anticorpi monoclonali specifici per trofozoiti, merozoiti, tipo I contro II meronts, e macrogamonts è diventato disponibile Questi anticorpi sarebbero anche molto efficaci nel segnare il progresso del parassita attraverso le sue life cycle of cryptosporidium parvum fasi del ciclo di vita negli organoidi.

I saggi di immunofluorescenza possono anche essere utilizzati per esplorare quali tipi di cellule sono infettati dal Cryptosporidium. Questo era particolarmente importante da guardare negli organoidi delle vie aeree come molto poco si sa sulla criptosporidiosi respiratoria, e la cellula ospite esatta per il parassita non era conosciuta.

Abbiamo condotto analisi dell'immunofluorescenza sugli organoidi infettati da Cryptosporidium, co-localizzando CC10, un marcatore per le cellule del club e abbiamo scoperto che il Cryptosporidium ha infettato sia le cellule negative che quelle positive CC10 Figura 3.

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Questi risultati sono stati confermati dai TEM in cui abbiamo osservato il Cryptosporidium infettare le cellule secretory e non secretorie nelle organoidi Dopo che gli organoidi differenziati sono stati infettati per cinque giorni, ci dovrebbe essere un numero significativo di oocisti prodotti.

Nelle nostre mani, l'infezione degli organoidi da una piastra a sei potraha prodotto circa oocisti, che potevano essere facilmente identificati e contati su un emocitometro etichettando con un anticorpo specifico per le ovocisti. La presenza di quattro sporozoiti nelle oocisti potrebbe essere confermata asciugando una parte delle oocisti su un vetrino adesivo, fissando con metanolo e combinando la colorazione DAPI con anticorpo specifico di oocisti Figura 4.

La verifica della produzione di oocisti murari spessi potrebbe essere effettuata mediante l'analisi TEM Figura 1: Preparazione e life cycle of cryptosporidium parvum di oocisti e sporozoiti di Cryptosporidium.

A Rappresentazione life cycle of cryptosporidium parvum del metodo utilizzato per la preparazione dell'oocisti e della sporozoite per l'infezione.

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B Immagine che mostra in vitro excystation di oocisti. La filtrazione di ovociti e conchiglie non esorditi dà una soluzione purificata di sporozoiti.

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Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Microiniezione di oocisti nel lume organoide. Questa cifra è stata modificata da Heo et al.

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A immagini di microscopia elettronica a scansione SEM di oocisti e sporozoiti. B Immagine che mostra organoidi iniettati di oocisti. Il colorante verde aiuta a visualizzare l'iniezione di ogni organoide e persiste su almeno 24 h.

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C Immagine di un organoide iniettato con oocisti. Figura 3: Immagine immunofluorescenza di Cryptosporidium life cycle of cryptosporidium parvum organoide delle vie aeree. La mucina è etichettata con anticorpo anti-mucina 5 rosso nel lume dell'organoid, le cellule del club sono etichettate con anti-CC10 gialloCryptosporidium viene rilevato con anticorpo oocyst-specifico verdee i nuclei cellulari sono macchiati con DAPI blu.

Pannello B è un allargamento dell'area indicata nel quadrato nel pannello A.

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Figura 4: Immagine immunofluoreescenza di oocisti isolati da organoidi intestinali differenziati. La parete oocyst è etichettata life cycle of cryptosporidium parvum anticorpo specifico di oocisti in verde e i quattro nuclei sporozoite sono visualizzati con DAPI blu Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La coltura dei parassiti del Cryptosporidium negli organoidi intestinali e delle vie aeree fornisce un modello accurato per studiare le interazioni ospite-parassita 10, ma ha anche molte altre applicazioni.

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Ad esempio, gli attuali metodi di selezione e propagazione dei parassiti del Cryptosporidium life cycle of cryptosporidium parvum modificati richiedono un passaggio nei topi 19, il che non consente l'isolamento dei parassiti che hanno modifiche essenziali per l'infezione in vivo. La cultura organoide del Cryptosporidium offre un'alternativa a questa procedura. Tuttavia, abbiamo notato che le sporozoite elettroporate si aggregano e bloccano la micropipetta.

Allo scopo di selezionare parassiti geneticamente modificati, gli organoidi possono essere coltivati su trasguarsi rivestiti di collagene in un formato bidimensionale in condizioni di https://ostrov.ru.com/contaminato/2093.php per consentire l'infezione da sporozoiti trasaffetti e di conseguenza la selezione di le oocisti geneticamente modificati.

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